ДСТУ EN 12146:2003 Соки фруктові та овочеві. Ферментативне визначення вмісту сахарози. Спектрометричний метод з використанням b-нікотинамід-аденін-динуклеотидфосфату (EN 12146:1996, IDT)
НАЦІОНАЛЬНИЙ СТАНДАРТ УКРАЇНИ
СОКИ ФРУКТОВІ ТА ОВОЧЕВІ
Ферментативне визначання вмісту
сахарози
Спектрометричний
метод з використанням
β-нікотинамід-аденін-динуклеотидфосфату
(EN 12146:1996,
IDТ)
ДСТУ EN 12146:2003
Не є офіційним виданням.
Офіційне видання розповсюджує
національний орган стандартизації
(ДП «УкрНДНЦ» http://uas.gov.ua)
ПЕРЕДМОВА
1 ВНЕСЕНО: ТК 23 по стандартизації «Продукція садів, виноградників та виноробна продукція» (ПК «Садівництво»)
ПЕРЕКЛАД І НАУКОВО-ТЕХНІЧНЕ РЕДАГУВАННЯ: А. Сирінський; Н. Чорнозубенко, канд. с.-г. наук; Г. Чорна; М. Бублик (керівник розробки), канд. с.-г. наук
2 НАДАНО ЧИННОСТІ: наказ Держспоживстандарту України від 10 червня 2003 р. № 101 з 2004-07-01
3 Стандарт відповідає EN 12146:1996 Fruit and vegetable juices — Enzymatic determination of sucrose content — NADP spectrometric method (Соки фруктові та овочеві. Ферментативне визначання вмісту сахарози. Спектрометричний метод з використанням β-нікотинамід-аденін-динуклеотидфосфату). Видано з дозволу CEN
Ступінь відповідності — ідентичний (IDT)
Переклад з англійської (en)
4 УВЕДЕНО ВПЕРШЕ
ЗМІСТ
Національний вступ
1 Сфера застосування
2 Нормативні посилання
3 Познаки та абревіатури
4 Принцип і хімізм методу
5 Реактиви
6 Устатковання
7 Проведення випробовування
8 Обчислювання результатів
9 Збіжність
10 Протокол випробовування
Додаток А Бібліографія
Додаток В Інформація про те, як обробляти «повзучі» реакції
Додаток С Статистичні результати міжлабораторного тестування
НАЦІОНАЛЬНИЙ ВСТУП
Цей стандарт є тотожний переклад EN 12146:1996 Fruit and vegetable juices — Enzymatic determination of sucrose content — NADP spectrometric method (Соки фруктові та овочеві. Ферментативне визначання вмісту сахарози. Спектрометричний метод з використанням β-нікотинамід-аденін-динуклеотидфосфату).
Технічний комітет, відповідальний за цей стандарт, — ТК 23 «Продукція садів, виноградників та виноробна продукція» (ПК «Садівництво»).
Стандарт містить вимоги, які відповідають чинному законодавству.
Додатки з познакою «довідковий» — наведено тільки для інформації.
Переклад структури стандарту не змінив і в нього не внесено технічних змін.
До стандарту внесено такі редакційні зміни:
— слова «цей європейський стандарт» замінено на «цей стандарт»;
— структурні елементи цього стандарту: «Обкладинку», «Передмову», «Національний вступ», «Зміст» та «Бібліографічні дані» — оформлено згідно з вимогами національної стандартизації України;
— англійські терміни та назви перекладено відповідно до термінології, прийнятої в Україні;
— до розділу 2 «Нормативні посилання» долучено «Національне пояснення», яке у тексті виділено рамкою.
Замість ISO 5725:1986 чинні:
ISO 5725-1:1994;
ISO 5725-2:1994;
ISO 5725-3:1994;
ISO 5725-4:1994;
ISO 5725-5:1994;
ISO 5725-6:1994.
Копії нормативних документів, на які є посилання у цьому стандарті, можна отримати у Національному фонді нормативних документів.
НАЦІОНАЛЬНИЙ СТАНДАРТ УКРАЇНИ
СОКИ
ФРУКТОВІ ТА ОВОЧЕВІ
Ферментативне
визначання вмісту сахарози
Спектрометричний
метод з використанням
β-нікотинамід-аденін-динуклеотидфосфату
СОКИ
ФРУКТОВЫЕ И ОВОЩНЫЕ
Ферментативное
определение содержания сахарозы
Спектрометрический
метод с использованием
β-никотинамид-аденин-динуклеотидфосфата
FRUIT
AND VEGETABLE JUICES
Enzymatic
determination of sucrose content
NADP spectrometric
method
Чинний від 2004-07-01
1 СФЕРА ЗАСТОСУВАННЯ
У цьому стандарті наведено ферментативний метод для визначання вмісту сахарози у фруктових та овочевих соках і у споріднених з ними продуктах.
2 НОРМАТИВНІ ПОСИЛАННЯ
Цей стандарт містить вимоги з інших публікацій за допомогою посилань на ці публікації із зазначенням і без зазначення року їхнього видання. Ці нормативні посилання наведені у відповідних місцях тексту, а перелік публікацій наведений нижче. Для посилань на публікації із зазначенням року їхнього видання наступні зміни чи наступні редакції цих публікацій дійсні для цього стандарту тільки в тому випадку, якщо вони введені в дію методом зміни чи методом підготовки нової редакції. Для посилань на публікації без зазначення року видання дійсне останнє видання наведеної публікації.
EN ISO 3696:1995 Water for laboratory use — Specification and test methods
ISO 5725:1986 Precision of test methods — Determination of repeatability and reproducibility for a standard test methods by inter-laboratory tests.
НАЦІОНАЛЬНЕ ПОЯСНЕННЯ
EN ISO 3696:95 Вода для лабораторного аналізу. Технічні умови і методи випробовування. Цей стандарт згармонізовано з ДСТУ ISO 3696. Ступінь гармонізації IDT
ISO 5725:1984 Точність методів випробовування. Визначання можливості повторення та можливості відтворення для стандартного методу тесту під час міжлабораторних тестувань.
3 ПОЗНАКИ ТА АБРЕВІАТУРИ
Для цілей цього стандарту використано такі познаки та абревіатури:
АТФ — аденозин-5'-трифосфат;
АДФ — аденозин-5'-дифосфат;
НАДФ — β-нікотинамід-аденін-динуклеотидфосфат;
НАДФН — β-нікотинамід-аденін-динуклеотидфосфат (відновлена форма);
Г-6-Ф — глюкоз-6-фосфат;
ГК — гексокиназа (ЕС 2.7.1.1)1);
Г6Ф-ДН — глюкоза-6-фосфат дегідрогеназа (ЕС 1.1.1.49)1);
БФ — β-фруктозідаза (ЕС 3.2.1.26)1);
МЕ — одна міжнародна одиниця ферментативної активності, що каталізує конверсію 1 мкмоль субстрату за хвилину за температури 25 °С;
с — концентрація речовини;
ρ — масова концентрація.
______________
1) Комісія з ферментів (ЕС); Посібник
з системи класифікації ферментів, Шпрінгер, Берлін, 1969.
4 ПРИНЦИП І ХІМІЗМ МЕТОДУ
4.1 Принцип методу
Сахароза підлягає ферментативному гідролізу (інверсії) під дією БФ у розчині зразка, що його випробовують, створюючи еквівалентну кількість D-глюкози і D-фруктози. Потім утворена D-глюкоза фосфорилюється в позиції С-6 в ході каталізованої ферментом реакції, з участю АТФ та ГК.
У супутній реакції Г-6-Ф, у присутності НАДФН, стехіометрично конвертується у 6-фосфоглюконат. Дана реакція каталізується ферментом Г6Р-ДН, а кількість НАДФН, що утворюється, еквівалентна вмісту D-глюкози, що утворилась у зразку, який випробовували (4.2).
Визначання кількості утвореного НАДФН, а звідси і вмісту D-глюкози та сахарози, проводять методом спектрометрії.
В соках з низьким вмістом сахарози (менше 5 г/л) і вищим вмістом глюкози неможливо точно встановити концентрацію сахарози за допомогою звичайного ферментного визначання. В таких випадках перед кількісним визначанням сахарози глюкозу слід видалити за допомогою реакції з йодом в лужному середовищі.
4.2 Хімізм методу
5 РЕАКТИВИ
5.1 Загальні положення
Використовують лише реактиви загальноприйнятого аналітичного класу чистоти і дегазовану воду, що відповідає принаймні 3-й степені якості згідно з EN ISO 3696.
5.2 Розчини гідроксиду натрію
Розчини гідроксиду натрію готують за умови, що с(NаОН) = 5 моль/л, с(NаОН) = 4 моль/л і с(NаОН)=2 моль/л.
5.3 Цитратний буфер з pH = 4,6
Розчиняють 6,9 г моногідрату лимонної кислоти (С6Н8О7 • Н2О) та 9,1 г дигідрату тринатрійцитрату (С6Н5Ма3О7 • 2Н2О) у 150 мл води, доводять до pH = 4,6 розчином гідроксиду натрію (с(NaОН) = 2 моль/л) (5.2) і доводять об'єм розчину до 200 мл водою. Буфер зберігає стабільність не менше 1 року за 4 °С.
5.4 Розчин β-фруктозідази
Розчиняють 10 мг β-фруктозідази, р = 5 мг/мл, близько 750 МЕ/мл, у 2 мл цитратного буфера (5.3). Розчин зберігає стабільність не менше 1 тижня за 4 °С.
5.5 Триетаноламіновий буфер pH = 7,6
Розчиняють 14,0 г гідрохлориду триетаноламіну і 0,25 г гептагідрату сірчанокислого магнію (МgSО4 • 7Н2О) у 80 мл води, приблизно 5-ма мл розчину гідроксиду натрію (с(NаОН) = 5 моль/л) доводять pH до 7,6 і доповнюють об’єм розчину водою до 100 мл. Буфер зберігає стабільність не менше 4 тижнів за температури 4 °С.
5.6 Розчин НАДФ
Розчиняють 60 мг динатрієвої солі β-нікотинамід-аденін-динуклеотидфосфат (β-НАДФ-Nа2) у 6 мл води. Розчин зберігає стабільність не менше 4 тижнів за температури 4 °С.
5.7 Розчин АТФ
Розчиняють 300 мг аденозин-5'-трифосфат динатрієвої солі (АТФ-Nа2Н2 • 3Н2О) і 300 мг бікарбонату натрію (NaНСО3) у 6 мл води. Розчин зберігає стабільність не менше 4 тижнів за температури 4 °С.
5.8 Суспензія ферментна ГК/ Г6Ф-ДН
Готують суспензію гексокінази з масовою концентрацією 2 мг/мл, близько 280 МЕ/мл (з D-глюкозою, що служить субстратом у присутності АТФ) та Г6Ф-ДН з масовою концентрацією 1 мг/мл, близько 140 МЕ/мл (з Г-6-Ф в якості субстрату) в розчині сульфату амонію, с((NН4)2SО4) = 3,2 моль/л. Суспензія зберігає стабільність не менше 1 року за температури 4 °С.
5.9 Розчин йоду
Розчиняють 130 г йоду і 150 г йодиду калію в достатній кількості води в мірній колбі об’ємом 1 л. Коли він розчиниться, доводять об’єм розчину водою до мітки.
5.10 Сірчана кислота
Розчин сірчаної кислоти з с(Н2SО4) = 0,5 моль/л готують із відповідного концентрованого стандартного розчину.
5.11 Розчини сульфіту натрія
Отримують насичений розчин сульфіту натрію у воді (розчинність ρ(Nа2SО3) = 12,54 г/100 мл за 0 °С і 28,3 г/100 мл при 80 °С). З цього насиченого розчину готують розбавлений розчин, розбавляючи водою у співвідношенні об’ємів 1 до 10.
5.12 Розчин фенолфталеїну
Готують розчин фенолфталеїну (ρ = 0,5 г/100 мл) в етанолі.
6 УСТАТКОВАННЯ
Використовують таке лабораторне устатковання:
6.1 Піпетки ферментні для досліджень, градуйовані лише вздовж стрижня з довгим неградуйованим наконечником.
6.2 Піпетки з точністю однаковою з піпетками, згідно з 6.1, наприклад, капілярні дозатори (замість 6.1).
6.3 Кварцеві, скляні або пластмасові кювети, з товщиною шару 10 мм, що не поглинає світло за робочої довжини хвиль (наприклад, 334 нм, 340 нм або 360 нм).
6.4 Фотометр з лінійчатим спектром освітлення, обладнаний ртутною лампою та фільтрами для вимірювання за довжини хвиль 334 та 365 нм.
6.5 Спектрофотометр (з довжиною хвилі, що настроюється) для вимірювання за довжини хвилі 340 нм (замість 6.4).
7 ПРОВЕДЕННЯ ВИПРОБОВУВАННЯ
7.1 Готування проби для випробовування
7.1.1 Звичайна підготовка проби
Фруктовий сік необхідно розбавити так, щоб концентрація сахарози/глюкози становила від 0,1 г/л до 1,5 г/л. Цей розчин треба використовувати негайно, і він не потребує попереднього обробляння. Результати розраховують на об’єм проби і виражають в розрахунку на 1 л зразка. Аналіз концентрованих продуктів теж можна виконувати в розрахунку на об’єм проби після її розбавлення до відомої відносної щільності. В цьому випадку відносну щільність необхідно вказати. Знаючи масу проби та враховуючи фактор розбавлення, результати можна виразити і в мг/кг продукту. У продуктах з високою в'язкістю і (або) дуже високим вмістом м’якоті (наприклад, м’язга) подання результатів в розрахунку на масу проби є звичайною процедурою.
Перед розбавленням каламутні зразки добре перемішують. Ці або сильно забарвлені зразки, можливо, потрібно буде розбавити більше, ніж того вимагає вміст сахарози. Освітлюють каламутні зразки, що містять дуже низькі концентрації сахарози, за допомогою попереднього центрифугування або мембранної фільтрації крізь фільтр з розміром пор 0,2 мкм.
7.1.2 Модифікована підготовка проби для визначання вмісту сахарози у разі високої концентрації глюкози
Фруктовий сік (освітлений фільтрацією або центрифугуванням, згідно з 7.1.1) розбавляють в співвідношенні 1:5. До 10 мл розбавленого (освітленого) фруктового соку, що помістили в мірну колбу місткістю 50 мл, додають 10 мл розчину йоду (5.9) та 2,5 мл розчину гідроксиду натрію з концентрацією 4 моль/л (5.2) (дотримуючись вказаної послідовності). Залишають колбу на 10 хв у темряві. Додають до цього розчину 10 мл розчину сірчаної кислоти (5.10). Надлишок йоду зв’язують додаванням насиченого та розбавленого розчинів сульфіту натрію (5.11) і струшуванням до повного зникнення жовтого/коричневого забарвлення.
Доводять рН розчину приблизно до 8 — 9 за допомогою титрування розчином гідроксиду натрію з концентрацією 4 моль/л (5.2), використовуючи індикатором розчин фенолфталеїну (5.12), до стійкого блідорожевого забарвлення. Отриманий розчин доводять до об'єму 50 мл і використовують для визначання вмісту сахарози.
7.2 Хід випробовування
7.2.1 Загальні положення
Випробовування необхідно проводити за постійної температури від 20 °С до 25 °С або постійної температури до 37 °С, якщо забезпечено отримання еквівалентних результатів.
Максимум світлопоглинання НАДФН відбувається за довжини хвилі 340 нм. Якщо використовують спектрофотометр зі змінною довжиною хвилі, то вимірювання проводять лише в максимумі поглинання. Коли використовують ртутну парову лампу з лінійчатим спектром випромінювання, то вимірювання проводять за довжини хвиль 334 і 365 нм.
Не використовують піпетки з однією позначкою (піпетки Мора). Розчини ферментів, коферментів та буферні розчини можна додавати подібними автоматичними піпетками. Піпетки ферментні для досліджень (6.1) або їхній еквівалент (6.2) потрібно використовувати для вимірювання розчину проби.
Аналіз можна проводити також з використанням комерційно доступного набору приладів для випробовування.
До цього методу рекомендовано долучати сахарозу у вигляді стандартного розчину.
7.2.2 Контрольний розчин для визначання сахарози
Вводять піпеткою в кювети 0,20 мл цитратного буферного розчину (5.3) і 0,02 мл розчину БФ (5.4). Перемішують і через 15 хв додають 1,00 мл буферного розчину триетаноламіну (5.5); 1,70 мл води, 0,1 мл розчину НАДФ (5.6) і 0,1 мл розчину АТФ (5.7). Перемішують і через 3 хв вимірюють поглинання (А1) розчину по відношенню до повітря (без кювети порівняння).
7.2.3 Контрольний розчин для визначання глюкози
Вводять піпеткою в кювети 1,00 мл буферного розчину (5.5); 1,92 мл води; 0,10 мл розчину НАДФ (5.6) і 0,1 мл розчину АТФ (5.7). Перемішують і через 3 хв вимірюють поглинання (А2) розчину по відношенню до повітря (без кювети порівняння).
7.2.4 Розчин сахарози, яку випробовують
Вводять піпеткою в кювети 0,20 мл цитратного буферного розчину (5.3); 0,10 мл розчину зразка і 0,02 мл розчину ВF (5.4). Змішують і через 15 хв додають 1,00 мл буферного розчину (5.5); 1,60 мл води; 0,1 мл розчину НАДФ (5.6) і 0,10 мл розчину АТФ (5.7). Перемішують і через 3 хв вимірюють поглинання (А3) розчину по відношенню до повітря (без кювети порівняння).
7.2.5 Розчин глюкози, яку випробовують
Вводять піпеткою в кюветки 0,1 мл розчину зразка; 1,00 мл буферного розчину (5.5); 1,82 мл води; 0,10 мл розчину НАДФ (5.6) і 0,1 мл розчину АТФ (5.7). Перемішують і через 3 хв вимірюють поглинання (A4) розчину по відношенню до повітря (без кювети порівняння).
7.2.6 Альтернативна процедура для визначання вмісту сахарози після усунення вільної глюкози
Згідно з 7.2.2 готують контрольний розчин сахарози, а також розчин для випробовування таким чином: вводять піпеткою в кювети 0,20 мл цитратного буферного розчину (5.3); 0,10 мл обробленого розчину зразка (7.1.2) і 0,02 мл розчину БФ (5.4). Змішують і через 15 хв додають 1,00 мл буферного розчину (5.5); 1,60 мл води; 0,1 мл розчину НАДФ (5.6) і 0,1 мл розчину АТФ (5.7). Перемішують і через 3 хв вимірюють поглинання (A9) розчинів по відношенню до повітря (без кювети порівняння).
7.2.7 Ферментативна реакція, визначання кількості сахарози
По кожному з розчинів 7.2.2; 7.2.3; 7.2.4; 7.2.5 і 7.2.6 окремо проводять наступну процедуру.
Додають 0,02 мл суспензії ферменту ГК/Г6Ф-ДН (5.8). Добре перемішують, чекають, поки реакція припиниться (10—15 хв.) і вимірюють поглинання розчинів (A5 для 7.2.2, А6 для 7.2.3, A7 для 7.2.4, A8 для 7.2.5 і А10 для 7.2.6). Закінчення реакції перевіряють за допомогою подальших вимірювань поглинань з інтервалами 2 хв. Якщо по закінченні цього часу реакція не закінчиться і поглинання продовжує зростати з постійною швидкістю, екстраполюють значення поглинання назад до моменту додавання ферментної суспензії ГК/Г6Ф-ДН (5.8).
Примітка. Для даного процесу характерні побіжні реакції, відомі під назвою «повзучі», про них детальніше піде мова в додатку В.
8 ОБЧИСЛЮВАННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
Реакції, на яких базується даний метод визначання, свідчать про існування лінійної пропорції між кількістю сформованої НАДФН (а звідси різниця поглинання ΔА) і концентрацією сахарози.
ΔАсахароза = ΔАзагальна глюкоза - ΔАгпюкоза (4)
ΔАзагальна глюкоза = (АB - А3) розчин сахарози, що випробов. - (А5 – A1) контрольний розчин для визн. сахарози (5)
ΔАглюкоза = (А7 - А4) розчин глюкози, що випробов. - (А6 – А2) контрольний розчин для визн. глюкози (6)
Якщо глюкозу усунуто попередньою реакцією з йодом, формула обчислення спрощується і має такий вигляд:
ΔАсахароза = (А10 - А9) розчин сахарози, що випробов. - (А5 – А1) контрольний розчин для визн. сахарози (7)
Розрахунок концентрації сахарози в розбавленому розчині за допомогою вимірювання світлопоглинання базується на законі Бера-Ламберта (Beer-Lambert).
Вміст сахарози (ρ) у грамах на літр зразка обчислюють за такою формулою:
|
ρ = |
M · V1
· F |
· ΔАсахароза (8) |
де М — молекулярна маса сахарози (342,3 г/моль);
V1 — загальний об’єм розчину в кюветі, мл;
V2 — об’єм розчину випробного зразка, доданого в кювету, мл;
F — фактор розбавлення розчину зразка (див. 7.1.1 або 7.1.2);
δ — товщина кювети, см;
ε — коефіцієнт екстинкції НАДФН:
за 340 нм = 6,31 ммоль-1 см-1;
за 365 нм = 3,51 ммоль-1 см-1;
за 334 нм = 6,181 ммоль-1 см-1.
ΔАсахароза - різниця поглинання.
Якщо об’єми, подані в 7.2.2, 7.2.3, 7.2.4, 7.2.5 і 7.2.6, не змінилися, то вміст сахарози (г/л) обчислюють за такою формулою:
|
ρ = |
10,34 · F · ΔАсахароза |
Концентрацію сахарози (г/л) відзначають з точністю до одного десяткового розряду.
Враховують розведення та проводять обчислення в розрахунку на об’єм чи масу. Якщо концентрований продукт був розведений до певної концентрації, то слід вказати відносну густину розведеного продукту.
9 ЗБІЖНІСТЬ
Деталі міжлабораторного тесту стосовно точності методу наведено у додатку С. Показники, одержані під час міжлабораторного тестування, не можна застосовувати для аналізу обсягів і типів зразків, окрім тих, що наведено у додатку С.
9.1 Повторність результатів
Абсолютна різниця між двома окремими результатами випробовування, одержаними на ідентичному матеріалі одним виконавцем з використанням тієї самої апаратури в межах якомога коротшого проміжку часу, не повинна перевищувати допущений рівень розбіжностей r більше, ніж у 5 % випадків.
Для звичайної підготовки зразка (7.1.1) показники такі:
яблучний сік r = 1,9 г/л;
нектар із чорної смородини r = 3,2 г/л;
нектар із абрикоса r = 3,9 г/л.
Для модифікованої підготовки зразка (7.1.2) показник такий:
r = 0,4 г/л.
9.2 Відтворність результатів
Абсолютна різниця між двома окремими результатами випробовування на ідентичному матеріалі, про яку повідомили дві лабораторії, не повинна перевищувати допущений рівень розбіжностей R більше, ніж у 5 % випадків.
Для звичайної підготовки зразка (7.1.1) показники такі:
яблучний сік R = 3,2 г/л;
нектар із чорної смородини R = 5,6 г/л;
нектар із абрикоса R = 6,9 г/л.
Для модифікованої підготовки зразка (7.1.2) показник такий:
R = 0,9 г/л.
10 ПРОТОКОЛ ВИПРОБОВУВАННЯ
Протокол випробовування повинен містити такі відомості:
— всю інформацію, необхідну для ідентифікації зразка (вид, походження і призначення зразка);
— посилання на цей стандарт;
— дата і спосіб відбирання зразків (якщо вони відомі);
— дата одержання;
— дата випробовування;
— результати випробовування і одиниці, в яких вони виражені;
— чи підтверджено можливість повторення методу;
— будь-які особливості, що спостерігалися у процесі випробовування;
— будь-які операції, не відмічені в методі або розглянуті як необов’язкові, але, можливо, вплинули на результати.
ДОДАТОК А(довідковий)
БІБЛІОГРАФІЯ
1 Determination of sucrose: Enzymatic method. № 56, 1985. In: The collected analyses of the International Federation of Fruit Juice Producers. Loose-leaf edition of 1996. Zug: Swiss Fruit Union.
2 Methods of enzymatic foods analysis Mannheim: Boehringer. 1980.
3 Methods of sampling and analysis of foods, tobacco products, cosmetics and commodity goods. Method 31.00-13 of the Collection of Official Methods, under Article 35 of the German Federal Foods Act. Federal Health Office. Loose-leaf edition of 1995. 08, vol. I. Berlin, Cologne: Beuth Verlag GmbH.
ДОДАТОК В(довідковий)
ІНФОРМАЦІЯ ПРО ТЕ, ЯК ОБРОБЛЯТИ «ПОВЗУЧІ» РЕАКЦІЇ
«Повзучі» реакції, як правило, спричинені побіжними реакціями фермента, присутністю інших ферментів у матриці зразка або взаємодією одного чи більше компонентів матриці з реагентом ферментативної реакції.
У звичайній реакції поглинання досягає постійної величини через певний час від 10 хв до 20 хв, що залежить від швидкості конкретної ферментативної реакції. Однак там, де мають місце побіжні реакції, поглинання не досягає постійної величини, а з часом постійно наростає, цей процес прийнято називати «повзучою» реакцією.
Якщо виникає ця проблема, то поглинання розчину слід визначати з постійними інтервалами від 2 хв до 5 хв після закінчення часу, необхідного, щоб стандартний розчин досяг свого кінцевого поглинання. В інтервалі, коли поглинання зростало з постійною щвидкістю (dА/dt = постійна швидкості), беруть 5—6 значень і екстраполюють графічно чи математично до поглинання розчину, яке могло мати місце в момент, коли була введена остаточна добавка ферменту (t0). Екстрапольоване значення поглинання в цій точці використовують для розрахунку різниці Аf – Аj, яку в свою чергу використовують для обчислення концентрації субстрату.
Рисунок В.1 — Повзуча реакція
ДОДАТОК С(довідковий)
СТАТИСТИЧНІ РЕЗУЛЬТАТИ МІЖЛАБОРАТОРНОГО ТЕСТУ
Відповідно до ISO 5725 у міжлабораторному тестуванні визначено такі параметри (відносно літератури, яка стосується методу, див. додаток А). Тестування було проведено Товариством харчової хімії, Франкфурт, Німеччина.
С.1 Звичайна підготовка зразка (7.1.1)
Рік міжлабораторного тестування — 1983
Кількість лабораторій — 22
Кількість зразків — 3
Типи зразків:
А — яблучний сік;
В — сік із чорної смородини
С — нектар із абрикоса.
Таблиця С.1
|
Зразок |
А |
В |
С |
|
Кількість лабораторій, які представили задовільні результати |
19 |
17 |
18 |
|
Кількість врахованих лабораторій (які представили незадовільні результати) |
3 |
5 |
4 |
|
Кількість прийнятих результатів |
99 |
88 |
90 |
|
Середнє значення (х̅) (г/л) |
10,2 |
22,9 |
63,6 |
|
Стандартний відхил повторності (sr) (г/л) |
0,6656 |
1,1355 |
1,3803 |
|
Відносний стандартний відхил повторності (RSDr) (%) |
6,5 |
5,0 |
2,2 |
|
Допустима границя повторності (r) (г/л) |
1.9 |
3,2 |
3,9 |
|
Стандартний відхил відтворності (sR) (г/л) |
1,1257 |
2,0084 |
2,4636 |
|
Відносний стандартний відхил відтворності (RSDR) (%) |
8,7 |
8,8 |
3,9 |
|
Допустима границя відтворності (R) (г/л) |
3,2 |
5,6 |
6,9 |
С.2 Модифікована підготовка зразка (7.1.2)
Рік міжлабораторного тестування — 1993
Кількість лабораторій — 11
Кількість зразків — 4 з додаванням сахарози
Типи зразків:
А — виноградний сік червоний;
В — виноградний сік білий;
С — томатний сік;
D — вишневий (черешневий) сік
Таблиця С.2
|
Зразок |
А |
B |
С |
D |
|
Кількість лабораторій, які представили задовільні результати |
10 |
9 |
11 |
9 |
|
Кількість відрахованих лабораторій (які представили незадовільні результати) |
1 |
2 |
- |
2 |
|
Кількість прийнятих результатів |
50 |
45 |
55 |
45 |
|
Середнє значення (х̅) (г/л) |
2,6 |
4,8 |
4,1 |
2,2 |
|
Стандартний відхил повторності (sr) (г/л) |
0,1005 |
0,1750 |
0,1631 |
0,0895 |
|
Відносний стандартний відхил повторності (RSDr) (%) |
2,9 |
3,6 |
4,0 |
4,1 |
|
Допустима границя повторності (r) (г/л) |
0,3 |
0,5 |
0,5 |
0,3 |
|
Стандартний відхил відтворності (sR) (г/л) |
0,3957 |
0,2919 |
0,3350 |
0,1211 |
|
Відносний стандартний відхил відтворності (RSDR) (%) |
15,2 |
6,1 |
8,2 |
5,5 |
|
Допустима границя відтворності (R) (г/л) |
1,1 |
0,8 |
0,9 |
0,3 |
67.160.20
Ключові слова: харчові продукти, соки фруктові та овочеві, хімічний аналіз, визначання сахарози, ферментативне визначання, спектрометричний аналіз.